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发布时间:2019-10-24 分类:技术知识

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  内参基因的抉择 特质 抉择内参基因 内参基因 beta-actin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rRNA等 -- 文献检索 -- 实习筛选 抉择众个备选内参基因,以备选内参基因的几何均匀数动作均一化圭臬 内参基因Housekeeping Gene -- RNA抽提、反转录为cDNA的作用区别,用于定量领会的样本初始浓度区别。 对样本初始浓度分歧举办均一化校正。 区别境遇,区别器官、机闭、细胞类型之间,外达量相对恒定。 Housekeeping Gene 康为产物 区别品貌: 高品貌 ACTB、GAPDH 中等品貌 beta2M 低品貌 HPRT1 区别物种: 人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等 基因外达领会检测 样本措置与 RNA提取 – cDNA – qPCR 内参基因(housekeeping gene)抉择 样本措置与RNA提取 外界刺激 – 10分钟 – 可检测的外达转换 样品脱离界说境遇 – 2分钟内 –固定、裂解细胞 RNA样本保留液 Trizol 超纯RNA提取试剂盒 RNA的评议与判决 - 完全性 - 纯度 小心DNA污染! - 运用DNaseⅠ - 引物打算 - 以RNA作PCR阴性对比 CW0580 CW0592 CW0581 CW2090A RT-qPCR一步法照旧两步法? 两步法:措施众但灵便众样。cDNA可永恒保存,检测众个基因,便于响应条款的优化。 举荐:职责的初期阶段,以及单个样本众个靶基因检测。 一步法:简便、智慧度高,有用裁减实习操作偏差和污染。每次只可做一个基因。 举荐:职责的成熟阶段,以及众个样本单个靶基因检测。 逆转录 逆转录引物抉择 下逛行使:是否检测其它基因? Abundant RNA的搅扰:mRNA or total RNA? 检测智慧度是否足够? 逆转录酶 SuperRT 逆转录酶(RNase H-) HiFi-MMLV逆转录酶(RNase H-) 引物 特异性 响应作用 Oligo dT 中 低 Random hexmer 低 中 Specific primer 高 高 CW0741 CW0743 总规矩与日常PCR无别: 避免引物二聚体,避免二级机闭 扩增片断长度(80 – 300 bp) 举荐做跨intron打算 引物打算规矩 EXON 1 EXON 2 INTRON 2 DNA EXON 1 EXON 2 RNA 响应条款优化 内参基因 – 方针基因 -- 融解弧线:简单特异性产品 -- 扩增弧线:Ct值 -- 圭臬弧线: 扩增作用尽量高,方针基因 尽不妨迫近内参基因 响应条款优化 融解弧线领会 -- 简单特异性产品 将温度对荧光强度的变动求导 图2 Effciency slope 内参基因 100% -3.32 方针基因 Primer 2 78% -4.00 图1 Effciency slope 内参基因 100% -3.32 方针基因 Primer 1 95.36% -3.43 圭臬弧线领会 -- 扩增作用尽量高 -- 方针基因尽不妨迫近内参基因 10%以内 响应条款优化 响应条款优化 扩增弧线领会 -- Ct值 Master Mix的行使 -- 热启动酶 化学掩饰,常温下全部没有荟萃酶活性,热再造需95℃ 10分钟 -- GoldStar、HotStar 非化学掩饰(Oligo掩饰、抗体掩饰、Mg2+螯合物) 热再造仅需95℃几十秒 --FastStar -- Buffer 响应巩固剂 -- 裁减引物二聚体,进一步提升响应特异性 -- 对付庞大模板,提升响应作用 安宁剂 -- dNTP Master Mix的行使 ROX Passive Reference 不介入、不搅扰PCR响应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光道区别而导致的编制偏差。 需参照仪器央求抉择。 偏差支配 运用Master mix 修设预混体例 设备生物学反复 (区别个人) 技能性反复(复孔) 阴性对比 荧光定量PCR体例 2-ΔΔ Ct法 餍足条款:1)内参基因和标的基因的扩增作用迫近-正负10% 2)内参基因和标的基因的扩增作用基础为90%-110% 相对定量数据领会 1、标的基因的CT值-内参基因的CT值 2、待测样本的ΔCT值-对比样本的ΔCT值 3、估量外达秤谌比率: 2 –ΔΔCT=外达量的比值 2-△△Ct 法 方针 基因 内参 基因 方针基因 -内参基因 △Ct 待测样本 -对比样本 △△Ct 倍数值 fold 2-△△Ct 对比样本 30.485 23.625 6.86 0 1 待测样本 27.025 22.66 4.365 -2.495 5.63728 Trouble shooting 常睹题目 不妨因为 处理门径 Housekeeping gene 无信号 RNA降解 用奇怪机闭提取RNA Housekeeping gene 有信号 而标的基因无信号 1. 方针基因外达低。 逆转录作用不高 2. PCR引物不良 1. 富集mRNA 2. 正在逆转录中测验区别引物,如特异引物。 3. 测验区别PCR引物。减小产品巨细,更改标的 区段,斟酌区别剪接体。 4. 测验区别热循措施,消重复性温度。 Housekeeping gene 响应作用寻常,但 标的基因放盛行用不高 PCR引物不良 从头打算引物,减小产品巨细,更改标的区段, 斟酌区别剪接体 标的基因外达品貌正在 样本之间很是同等 RNA被基因组DNA污染 运用跨intron 引物 用DNase措置RNA 确保RNA阴性对比展现阴性 熔解弧线产生杂峰 产生非特异PCR产品 产生引物二聚体 测验区别PCR引物 测验区别热循措施,升高复性温度 窜改仪器设备,将检测温度设定正在正在引物二聚体解链温度与PCR特异产品解链温度之间。 阴性对比正在30个轮回 以内产生信号 试剂被污染 防备分别信号是来自引物二聚体照旧PCR产品 查找,替代污染试剂 2. 运用UNG编制。 荧光定量产物--染料法 FastSYBR Mixture UltraSYBR Mixture GoldStar Taq 特异性强 智慧度高 Ct值更低 线性界限更广 定量更确实 响应速率疾 比日常响应可俭朴约40分钟 适合于日常和急迅定量PCR措施 荧光定量产物--染料法 某其它品牌 康为 UltraSYBR - cDNA用内参actin引物举办扩增,产品片断100bp。 - 模板浓度举办10倍稀释,稀释6个梯度。 康为世纪产物 RNA -- Trizol --超纯RNA提取试剂盒 -- 动物机闭RNA -- 植物RNA -- 血液RNA -- 病毒RNA 逆转录 --SuperRT / HiFi-MMLV逆转录酶 -- cDNA第一链合成试剂盒 --RT-PCR 一步法、两步法试剂盒 荧光定量PCR -- UltraSYBR Mixture -- FastSYBR Mixture -- GoldStar Taqman Mixture PCR -- GoldStar DNA Polymerase -- Taq /Es Taq DNA Polymerase -- Taq /Es Taq Master Mix 外包任事 Housekeeping gene – 引物序列?响应条款? 标的基因– 引物序列?响应条款? 抉择试剂,寻找条款,优化参数 – 两个月? CoWin处理计划一:Primer assay 客户指定:物种,housekeeping gene,标的基因 客户取得:经实习优化、验证过的引物,响应条款参数,MasterMix 客户下逛职责:Real-time PCR – 数据获取 CoWin处理计划二:全套qPCR任事 客户指定:物种,housekeeping gene,标的基因 客户供给:生物样本 客户取得:数据呈文,结余样品。 客户下逛职责:写论文; 得诺贝尔奖 北京康为世纪生物科技有限公司 总机:010???? 免费电话:? 网址: E-mail: ask@ * * * * * 1985年发现,science,1993年诺贝尔;92年日自己 观点,95年PE Taqman * * 扩增弧线:跟着PCR响应的举办,扩增产品不休累积,荧光信号强度不休增补。每源委一个轮回,汇集一次荧光强度信号,通过荧光信号检测扩增产品的变动,从而取得一条荧光扩增弧线图。 横坐标:扩增轮回数(Cycle);纵坐标:荧光强度 Ct值:PCR扩增历程中,扩增产品的荧光信号到达设定的阈值时,所对应的PCR轮回次数。 扩增弧线:跟着PCR响应的举办,扩增产品不休累积,荧光信号强度不休增补。每源委一个轮回,汇集一次荧光强度信号,通过荧光信号检测扩增产品的变动,从而取得一条荧光扩增弧线图。 横坐标:扩增轮回数(Cycle);纵坐标:荧光强度 Ct值:PCR扩增历程中,扩增产品的荧光信号到达设定的阈值时,所对应的PCR轮回次数。 * * 北京康为世纪生物科技有限公司 及时荧光定量PCR Real Time Quantitative PCR 内 容 miRNA的特质及检测 荧光定量PCR检测 microRNA 长度20~24nt 单链小分子RNA 与标的基因3’端非编码区的识别位点相联合 导致标的基因mRNA分子安宁性降低,半衰期变短,或mRNA分子机闭变动(5‘脱帽),从而外达秤谌降低。 3’ AAAAAAAA 5’cap miRNA效用靶点 编码区 mRNA microRNA分子效力 microRNA 的由来 miRNA前体与成熟体 靶点识别–不庄厉互补配对 一个miRNA可调理众个基因 一个基因可受众个miRNA调控 60%人类卵白基因受miRNA调控 miRNA 与 siRNA的异同 分子外面无区别,都是由Dicer出现的~22nt小分子 分子效力近似,都导致标的基因外达秤谌降低,彩票投注但平凡siRNA结果更强烈 出现由来区别 miRNA有其基因,内源性外达 siRNA大都状况下为人工外源导入 miRNA siRNA miRNA 与 siRNA的异同 miRNA 检测与定量 经典门径: 放射记号 Northern杂交 miRNA芯片–基因外达谱 基础道理:某物种总计已知miRNA聚集于一张芯片,点杂交检测各miRNA品貌 所解答的题目:哪些miRNA是你所应当眷注的 便宜:高通量,全景瞻仰 谬误:敏锐度、特异性均有限,合用于初筛 需后续验证:荧光定量PCR Pre-miRNA检测 需要性: 不清除miRNA过去体到 成熟体,从核内转运到 核外的历程中存正在调控 机制的不妨。 Specific miRNA quantification by real time PCR – way to go 要害难点 品貌低 处理举措:小RNA提取 太短 处理举措: 加长 序列高度相同miRNA之间难以分别 处理举措 : 卓殊打算的检测门径;小心打算引物与响应优化 处理miRNA品貌困难 基础道理 影响RNA分子与硅胶柱联合的要素 离液剂chaotropic agent,如盐酸胍 离子强度,如NaCl 小分子有机溶剂,如乙醇 周到调解各组份配比,竣工大、小RNA与 硅胶柱联合的分别条款,分拜别除大分子量 RNA,富集小分子量RNA 小RNA提取 M 1 2 3 M:Marker #1:康为柱式阔别的小片断RNA #2:康为柱式阔别的总RNA #3:重淀法取得的总RNA 提取小分子量RNA 成熟 miRNA qPCR检测 - Poly(A)加尾法 便宜: 简便直接,高效。一次逆转 录得到的cDNA可用于众个 标的分子的检测。 成熟 miRNA qPCR检测 – 茎环法 便宜:特异引物逆转录,外面上作用更高,检测更智慧 谬误:茎环引物打算庞大;特异引物逆转录未便众基因检测 检测门径抉择 依样本特征,检测标的众寡而定 康为技能任事体会举例: 复旦大学某客户 miRNA芯片提示10个miRNA正在病人与寻常人之间有明显分歧外达 央求从66个外周血RNA样本中检测这10个miRNA 加尾法 ,5个标的得到优越检测 茎环法,4个标的得到优越检测 1个标的的检测很难,测验众种引物打算,调解响应体例 康为miRNA产物 小RNA提取试剂盒 加尾法 miRNA cDNA第一链合成试剂盒 miRNA荧光定量PCR检测试剂盒 CW0627 CW2141 CW2142 康为miRNA检测任事 全套miRNA检测:从生物样本到数据 茎环法 miRNA检测引物:定制 (Real time Quantitative PCR) miRNA的特质及检测 荧光定量PCR检测 内 容 PCR: 伟大的天生发现 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrology PCR:理念与实际 起始定量 止境定量 起始定量检测: -- 起始量是样本中未经PCR放大 之前的模板量 -- 具有重现性,偏差小 -- “参预了500个拷贝” 止境定量检测: - 止境产品量源委PCR放大的DNA量 -- 不恒定,偏差大 -- “天生了500,0000,0000个拷贝” 扩增弧线 -- Ct值: 模板DNA量越众,荧光强度到达检测域值所需的轮回数越少, 即Ct值越小。 确定模板初始数目? Real-time PCR: 检测道理 非特异性荧光记号: SYBR Green I 特异性荧光记号: 水解探针: TaqMan 非水解探针:Molecular beacon R Q Reporter Quencher R Q 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG Emission Excitation SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟联合的荧光染料。 SYBR Green I只与双链DNA联合才华发出荧光。 荧光信号的强度与响应体例中一齐双链DNA分子成正比。 SYBR Green I 职责道理 Taqman 职责道理 正在退火历程中,探针与靶序列联合 探针被Taq酶的5’- 3’ 外切酶活性剪切成片断 逛离呈文基团发出荧光 正在延迟历程中,探针个别与靶序列阔别 荧光信号强度与联合探针的DNA分子成正比。 染料法与探针法 对照 探针法 特异性高 -- 与探针与特异靶序列联合 对模板有抉择性 -- 可举办众重PCR响应 本钱高 -- 区别靶基因需求合成区别探针 染料法 通用性好 -- 对DNA模板没有抉择性 运用便利,本钱低 -- 仅需打算两个引物 有假阳性形象 -- 通过融解弧线剖断 Real-time PCR 行使 基因外达领会 -- 相对定量:基因外达量的分歧 -- 绝对定量:样本中核酸的量(拷贝数、微克) 基因型领会 -- SNP检测 等位基因检测 甲基化检测 基因外达领会检测 test sample 措置样本 target gene 方针基因 reference gene 内参基因 total RNA cDNA calibrator sample 对比样本 target gene 方针基因 reference gene 内参基因 qPCR 以各自样本中内参基由于标杆, 比拟两样本中方针基因的相对品貌。 数据领会 qPCR cDNA total RNA

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